硬組織的病理觀測對于研究骨骼、牙齒等器官疾病的發展具有很重要的意義。但是硬組織由于其本身硬度大難以被傳統的薄片切割機直接切割，因此在切割之前往往需要脫鈣處理，使其軟化以達到刀片所能夠承受的硬度范圍內進行切割。但是鈣質作為骨骼和牙齒的組成部分，進行脫鈣將不可避免的丟失所研究器官中的信息，尤其是在含鈣量高的牙釉質等部位中。同時，鈣在早期硬組織愈合如牙質修復、骨創傷愈合等過程中也起著重要作用。另外脫鈣還不可避免的改變了硬組織的形貌，諸如厚度變化、褶皺、軟硬組織分離等問題。因此尋找無需脫鈣的切割方法對于研究硬組織研究是十分必要的。

    隨著激光技術的發展，這難題有望得到解決。對于刀片切割來說，受到刀片材料本身的限制，無法切割比刀片更硬的物體，但是這個困難在激光切割中并不存在 。然而激光切割也有其缺點：作為種高能光束，其本身蘊含的能量較高容易灼傷物體表面，從而影響切割效果；另外受到激光在穿透物體時將不可避免的被所穿透物體中的組分散射，從而限制了激光切割的深度。近幾年發展較為迅速的雙光子聚焦技術給激光3D切割帶來了新的可能。

    雙光子切割具有如下勢：雙光子能夠穿透定深度的樣品，因此能夠直接在物體內部進行切割，進而實現對組織深層區域的切割；其次雙光子的聚焦點能夠控制，可實現以往切割設備不能實現的3D切割；另外雙光子般采用近紅外激光作為激發光源，這類激光往往擁有杰出穿深并且對于蛋白的吸收較低，基本不會灼傷樣品。后雙光子切割相比于傳統打磨方法來說更為，樣品的損失更少。

    在制樣上來說，雙光子切割也十分的簡單。根據目前文獻上主要采用的方法可以總結為：使用甲醛固定，然后使用PMMA包埋，接下來使用雙光子激光切割設備切割，經過簡單打磨后，就可以染色壓片了。這比起傳統的硬組織切割步驟更為簡單，制備時間更短。并且制備效果比傳統方法更。 

雙光子切割實際效果圖精選

觀察骨組織的修復過程

激光切割人體第四腰椎垂直切片前部。C. SEM; D. PLM; E. SEM + PLM。從圖中可以清晰看到骨組織表面修復。 

觀察基因缺陷對骨組織的影響 

小鼠脛骨的SEM圖像。A.Phospho1敲除（KO）的脛骨近端顯示非礦化基質類骨；B. 脛骨骨干。白色箭頭顯示骨髓內表面的骨樣斑塊。黑色箭頭顯示位于皮質血管的骨樣區（向下至20-50 lm區域）的大小變化；C. 膝蓋。致密纖維結締組織骨膜位于白色箭頭處；D.WT的對照關節。 

觀察手術后的骨組織再生 

節段性缺損愈合的組織形態學評價。a-d。Safranin Orange/von Kossa染色觀測修復手術愈合效果的脛骨代表性圖片，LA，外側；ME，內側；PR，近端；DI，遠端，對側鋼板。e.手術后周內采集的對照樣本作標本圖片。自體松質骨移植（ABG）對蜂巢的增強作用黑色（藍色星）和支架中心孔內明顯的截骨術血腫（白色星）仍然可見。 

牙齒病理觀測

大鼠牙本質切片觀測	人牙齒切片觀測

參考文獻

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