單細胞測序在疾病診斷和細胞異質性研究中發揮著重要作用。然而目前的單細胞測序手段需要將細胞消化并裂解才能夠進行，而細胞狀態在這操作中不可避免的會發生改變，因此很難掌握細胞真實的基因表達情況，尤其對于基因通路上表達變化的檢測為不。近期蘇伊士理工大學使用FluidFM創建了種原位活細胞基因測序方法，這種方法能夠在不殺死細胞的情況下完成對細胞的測序工作。通過這種技術該團隊成功完成單細胞RNA基因測序，并通過這種方法檢測到了細胞的基因表達和細胞周期狀態變化。下面本文就這項工作的具體內容進行闡述。

1. Live-Seq測序技術簡述

由于單個細胞的RNA總量僅有10 pg。為了實現無損的單細胞測序，該團隊使用FluidFM對現有的scRNA-Seq單細胞測序的方法進行了化。為了盡可能的接近Smart-Seq的測試條件，該團隊采用了將緩沖液吸入探針，然后再進行細胞提取的操作。這樣可以確保所提取的RNA能夠很快與緩沖液混合，從而避免RNA的降解。通過這方法，該團隊成功實現了IBA細胞的測序，證明了這種方法的可行性（圖1）。

圖1. Live-Seq技術

a. Live-Seq技術的示意圖和代表圖片，黑色箭頭指代液面；b. IBA細胞測序的質量控制圖（n=10）。

2. Live-Seq技術分析細胞系和細胞狀態
 

為了證實Live-Seq的有效性，該團隊對多種細胞系進行了測序，這其中包括IBA細胞、小鼠脂肪干細胞和祖細胞（ASPCs）以及脂多糖處理的RAW264.7細胞和Mock處理的RAW264.7細胞。通過對這些細胞系進行測序發現，該方法能夠區分上述細胞系，并且在征基因檢測中能夠找到每種細胞所對應的征基因，證明了Live-Seq方法的有效性（圖2）。

圖2. Live-Seq單細胞測序區分細胞型及細胞狀態

a. 實驗方法示意圖，使用LPS和PBS對RAW細胞進行處理；b. 前500個高度易變基因的tSNE圖；c.1~10的細胞型、細胞狀態差別基因的熱圖；d. 小鼠基因圖譜預測，使用1~100個標記基因的團簇；e. Live-Seq對比scRNA-Seq的錨點分析，顯示兩者沒有顯著差異。

3. Live-Seq技術對細胞的活力基本沒有影響
 

Live-Seq技術的顯著勢在于提取過程中不會破壞細胞。通過對提取前后的測序對比可以發現，提取組與空白組之間的團簇沒有顯著性差異。并且通過對細胞形態的觀察，發現細胞的形態基本沒有改變，并且多數細胞仍然能夠正常分裂（圖3）。

圖3. Live-Seq對細胞活力的影響

a. 細胞實驗的示意圖；b. Live-Seq測序后不同時間點（1h,4h）的scRNA-Seq的tSNE圖；c.不同時間點scRNA-Seq所有能夠發現差異的基因（共12個）；d.不同時間點的細胞形態圖片。

4. Live-Seq技術能夠記錄細胞下游分子表型事件
 

由于Live-Seq對細胞生理狀態影響小，因此能夠監測在細胞代謝過程中的基因變化。通過對比LPS處理的巨噬細胞周期實驗發現，Live-seq技術與對照組的細胞代謝水平相比沒有明顯變化，因此這種方法測量的數據十分接近細胞代謝中基因表達的真實水平。通過測序對比LPS處理與空白的測序結果發現Nfkbia與Tnf的表達為相關。這結果也驗證這種測序方法在檢測細胞下游表型時的勢。

圖4. Live-Seq技術的單細胞縱向分析

a. 實驗示意圖；b. 不同處理細胞的mCherry強度變化；c. 3~7.5h之間mCherry強度變化；d. Tnf-mCherry強度變化的線性回歸模型；e. Nfkbia與Tnf在Live-Seq測序中的表達關系；f. Nfkbia與Tnf在scRNA-Seq測序中的表達關系；g. Live-Seq測序中細胞處于S期的評分；h. Live-Seq測序中細胞周期的mTnf-mCherry強度變化；i.Tnf-mCherry的熒光強度增量（3~7.5h）。

5. Live-Seq技術對同細胞多次測序
 

Live-Seq技術的無損性甚至能夠實現對單個細胞的多次測序。通過對單個細胞兩次提取后細胞活力變化的觀察中發現，細胞的活力即使在2次提取后仍沒有發生明顯的變化，基因型分析也沒有發現明顯的基因表型改變。

圖5. Live-Seq對細胞的多次提取

j.連續測序的示意圖和代表圖像；k.Live-Seq的tSNE圖；l.整合Live-Seq和scRNA-Seq的tSNE圖。

6. 總結
 

Live-Seq是種十分具有前景的單細胞測序的新方法，得益于FluidFM技術的無損提取的勢，Live-Seq技術除了能夠實現傳統測序的功能外，還降低了細胞的損傷，能夠提供更加原生和真實的測序信息。這種點甚至讓單細胞的基因表達動力學研究成為可能。相信隨著這種技術自動化的提高，將為單細胞測序技術帶來更多可能。

參考文獻：

[1]. Genome-wide molecular recording using Live-seq, Wanze Chen, Orane Guillaume-Gentil, Riccardo Dainese, Pernille Yde Rainer, Magda Zachara, Christoph G. Gäbelein, Julia A. Vorholt, Bart Deplancke, bioRxiv 2021.03.24.436752;

DOI: //doi.org/10.1101/2021.03.24.436752

 

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