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TECHNICAL ARTICLES科研進展
Moorfield薄膜生長設備的用戶英國劍橋大學Christopher J. Russo教授研究組用高質量的薄膜生長與加工技術制備了用于冷凍電鏡樣品制備的“HexAuFoil”金屬網,該金屬網使得冷凍電鏡觀察生物大分子樣品時樣品的位置漂移小于1埃米,進步提高了冷凍電鏡的成像質量,該結果刊登在2020年10月的Science雜志上。“HexAuFoil”金屬網制備過程中的關鍵環節就是采用Moorfield提供的高精度電子束蒸發技術以及液氮冷卻的低溫樣品臺,使得Au膜當中的粒徑更小,在縮小金屬網圓孔直徑的情況下仍保證了金屬網孔的圓度和質量。
圖1:生長在Si 片上的“HexAuFoil”金屬網陣列
(圖片由分子生物學MRC實驗室的Neil Grant提供)
說到冷凍電鏡,近幾年在分子生物學方向可謂是大放異彩,我國生物學家用冷凍電鏡技術在結構生物學方面也做出了許多舉世矚目的重要成果。冷凍電鏡技術幾乎完·美的實現了對生物大分子的高精度觀察。但在實際應用中仍有很多因素限制了冷凍電鏡觀測精度的進步提升。其中重要因素之是由于電子束照射導致金屬網上的玻璃態的水膜發生移動從而影響觀測精度。英國劍橋大學的Christopher J. Russo研究組對金屬網上玻璃態水膜的移動建立了物理模型,通過分析得出水膜的直徑和厚度存在個臨界比值,超過臨界比值,水膜在快速冷凍過程中會由于應力作用發生彎曲,并有部分應力凍結在內部。而在電子束照射時,由于電子束照射作用提高了水膜中水分子的擴散系數(~1046倍),玻璃態的水膜便成為了個“超粘流體”,水膜的應力會進步的釋放使得水膜的曲率發生變化,從而導致了生物大分子的位移,而這個位移只發生在電子束照射時,從而影響成像質量。
圖2:A冷凍電鏡在觀測時樣品的位置移動,B、C不同角度,不同孔徑對位移的影響,D水膜曲率變化導致樣品位移的示意圖。E孔徑比的臨界值(孔的直徑/水膜厚度)
如果縮小金屬網孔的直徑,使水膜的直徑和厚度比值在臨界以內,在冷凍時水膜內聚集的能量不足以使水膜發生彎曲,電子束照射的能量也不會引發水膜曲率的變化,僅僅會引起水分子的擴散,而擴散對成像的影響遠小于曲率的變化。從而可以提高冷凍電鏡的成像質量。因此制備高精度小孔徑金屬網格就顯得尤為重要。Christopher J. Russo課題組用了高精的光刻和電子束蒸發薄膜制備技術在硅片上成功的批量制備出了孔徑在200 nm尺度的金屬支撐網,使得冷凍電鏡測量時樣品的位移小于1埃米。
圖3:用“HexAuFoil”金屬網的冷凍電鏡觀測結果
后作者用制備的“HexAuFoil”金屬網對223-kDa DPS蛋白質進行了冷凍電鏡的觀測。結果表明,采用“HexAuFoil” 金屬網可以有效減小樣品的移動,使得分辨率輕松突破2埃米(更多細節請參考原文)。該篇文章介紹了種減小樣品位置漂移提高冷凍電鏡精度的有效途徑。
Moorfield薄膜制備與加工設備
Moorfield Nanotechnology是英國材料科學域高性能儀器研發公司,成立26年來注于高質量的薄膜生長與加工技術,擁有雄厚的技術實力,推出的多種高性能設備受到科研與工業域的廣泛好評。Moorfield公司近十年來與曼徹斯大學諾獎技術團隊緊密合作,推出的臺式高精度薄膜制備與加工系列產品由于其體積小巧、性能·越、易于操作更是受到很多科研單位的贊譽。Moorfield Nanotechnology推出的大型系列設備具有更大的配置自由度,可以滿足各種用戶的殊功能需求,并且接受設備的殊定制化設計。
冷凍電鏡背景介紹
2017年諾貝爾化學獎頒給了發明冷凍電鏡(Cryo-EM)的三位科學家,哥倫比亞大學教授Joachim Frank、蘇格蘭分子生物學家和生物物理學家Richard Henderson、以及瑞士洛桑大學生物物理學榮譽教授Jacques Dubochet以表彰他們在冷凍顯微術域的貢獻。嚴格來說,其實這次化學獎是頒發給了三維“物理學家”以表彰他們對生物域做出的·越貢獻。Richard Henderson在20世紀90年代改進了電子顯微鏡,實現了原子分辨率;Joachim Frank在70、80年代開發了種圖像合成算法,能將電子顯微鏡模糊的二維圖像解析合成清晰的三維圖像;Jacques Dubochet發明了迅速將液體水冷凍成玻璃態以使生物分子保持自然形態的技術。這些發明使低溫冷凍電子顯微鏡得到很大的化。
為什么觀察蛋白質等生物大分子需要冷凍電鏡呢?這是由于蛋白質等生物大分子往往只能保存在水溶液中無法滿足電鏡的真空要求,并且這些生物大分子是通過氫鍵鏈接的,電子的轟擊會導致氫鍵斷裂破壞分子結構,此外蛋白質等活性物質是運動的,不是個靜止狀態。由于以上原因,普通電鏡是不能用于觀察蛋白質等生物活性物質的。科學家們經過探索發現,快速冷凍可使水在低溫狀態下呈玻璃態,減少冰晶的產生(水凝結成冰晶體積會膨脹從而會破壞生物分子結構),從而不影響樣品本身結構,生物大分子就可以冷凍在這個玻璃態的水里,通過冷凍傳輸系統保證在樣品始終保持在低溫狀態下,這樣就可以對樣品進行電鏡觀察了。然后用計算軟件通過大量的二維照片解析出生物大分子的三維結構,這便實現了對生物大分子的高精度觀測。
近些年來,冷凍電鏡在結構生物學域大放異彩,使得對蛋白質等生物大分子的研究取得了長足的發展。我國生物學家去年在新·冠病毒研究方面取得的諸多進展中也有很多重要的工作都用到了冷凍電鏡技術。
【參考文獻】
[1]. Naydenova K , Jia P , Russo C J . Cryo-EM with sub–1 specimen movement[J]. Science, 370.
【相關產品】
//www.chem17.com/st166724/product_34731514.html2.臺式高性能多功能PVD薄膜制備系列—nanoPVD//www.chem17.com/st166724/product_34660266.html3.多功能高磁控濺射噴金儀—nanoEM//www.chem17.com/st166724/product_34736871.html4.臺式精準氣氛\壓力控制高溫退火系統—ANNEAL//www.chem17.com/st166724/product_34736567.html5.臺式二維材料等離子軟刻蝕系統—nanoETCH//www.chem17.com/st166724/product_34660308.html6.臺式高性能CVD石墨烯/碳納米管快速制備系列—nanoCVD//www.chem17.com/st166724/product_34660149.html