導讀:
近年來,光學顯微鏡的技術發展日新月異。其中,熒光顯微鏡技術的迅猛發展更是極大地改變了生命科學的研究方式,已經成為目前生命科學研究者對細胞、組織進行成像的方法。
然而,熒光顯微鏡技術均需要對成像目標進行熒光分子探針標記。這類熒光分子探針常易受光、氧、溫度、pH等因素的影響,從而失去活性,導致實驗數據不準確;并且有些熒光探針對不同的目標分子具有一定的親和性,這導致無法對目標分子進行準確的測量,特異性不高。此外,由于熒光顯微鏡的波段限制,一次實驗通常不能使用超過6種顏色的熒光標記分子。這些技術條件限制了熒光顯微鏡技術在生物科學領域的進一步拓展應用,尤其在代謝組學、細胞生物學、藥物學等需要對多種類目的蛋白或化合物進行成像的研究領域,科研工作者亟需一種能夠兼具熒光成像和化學成像功能的新型顯微鏡技術。
新一代化學成像顯微鏡
美國PSC公司研發的新一代高分辨化學成像顯微鏡——mIRage,極大地拓展了光學顯微鏡的應用。mIRage不僅具備傳統熒光顯微鏡的熒光成像功能,還采用新型光學光熱紅外(O-PTIR)技術,能夠對物質的分子結構進行無熒光標記的化學成像,解決了傳統化學成像空間分辨率低的問題,其化學成像分辨高達500 nm,可在亞微米尺度上對細胞或組織內的目的蛋白或分子進行表征。這為代謝組學、細胞生物學、藥物學等多個生命科學研究領域提供了新的手段,是對傳統光學顯微鏡的全新拓展和補充。
mIRage部分應用領域
新一代高分辨化學成像顯微鏡——mIRage
mIRage的優勢:
• 亞微米空間分辨的紅外光譜和拉曼高光譜成像(~500 nm);
• 與透射模式相媲美的反射模式下的圖譜效果;
• 非接觸測量模式—使用簡單快捷,無交叉污染風險;
• 很少或無需樣品制備過程(無需薄片), 可測試厚樣品;
• 可透射模式下觀察溶液中的樣品;
• 實現同時同地相同分辨率的IR和Raman測試;
• 熒光顯微成像實現熒光標記樣品快速定位。
一、mIRage助力單細胞脂質代謝成像分析
加州大學圣巴巴拉分校的Kenneth S. Kosik研究組以棕櫚酸疊氮化物(azide-PA)作為探針,使用mIRage檢測體外細胞模型中新合成的脂質以研究細胞脂代謝。該成果以Single-cell mapping of lipid metabolites using an infrared probe in human-derived model systems為題發表在Nature communication(影響因子16.6 ) 上。
在本研究中,該團隊構建了一個單細胞代謝成像平臺,能夠在各種人類衍生的 2D 和 3D 培養系統中以高特異性直接成像脂質代謝。通過加入疊氮化物標記的紅外探針(azide-PA),可用作核苷酸的修飾標記,脂肪酸代謝的分子探針;azide-PA加入培養基后,可被細胞利用合成甘油三酯,磷脂和固醇類。mIRage檢測azide-PA的光譜結果顯示和PA相比,其在2100cm-1具有疊氮基團的吸收峰,因此azide-PA非常適合用于檢測細胞內的脂質分布。該團隊通過此體系在前顆粒蛋白敲低的人類誘導多能干細胞及其分化的小膠質細胞中發現了上調的脂質代謝。
如上圖所示,該團隊將hiPSC與神經膠質細胞在含有azide-PA的培養基中培養24h后,使用mIRage進行成像發現,神經膠質細胞在2096 cm-1和1744 cm-1的信號強度(圖A&圖B),及總脂質/蛋白比(1740/1650)與新合成脂質/總脂質比(2096/1740)均高于hiPSC(圖C&圖D),表明在hiPSC分化過程中脂質的合成更加活躍,脂質的合成可能與早期腦發育有關。
綜上所述, mIRage可以在亞微米水平進行高分辨率的單細胞化學成像分析,這項技術將帶來更多生物領域的新發現,助力開發更有效的疾病療法。
二、mIRage助力單細胞化學成像
瑞典隆德大學的Oxana Klementieva與Gunnar K. Gouras團隊使用光熱紅外和X射線熒光直接對神經元中的微量元素和相關分子結構進行化學成像,在這一研究中該團隊使用mIRage對單神經元細胞中β淀粉樣蛋白的分布和結構進行了分析,該成果在2021年以Correlative optical photothermal infrared and X-ray fluorescence for chemical imaging of trace elements and relevant molecular structures directly in neurons為題發表于Light: Science and Applications(影響因子20.6)上。
在這項研究中,該團隊結合了兩種位于電磁波譜兩端的成像模式用于直接評估單個神經元中的結構和化學信息。結合基于新型光熱紅外 (O-PTIR)和同步加速器 X 射線熒光 (S-XRF) 納米成像技術的無標記超分辨率微光譜進行亞細胞成像并捕獲了同一神經元中β淀粉樣蛋白的纖維形式。該研究發現在原代AD樣神經元中,鐵簇與升高的淀粉樣蛋白β片層結構和氧化脂質共定位。
如上圖所示,該團隊使用mIRage和S-XRF對單細胞整合成像,該團隊首先使用mIRage可視化了β淀粉樣蛋白片層結構和氧化脂質的分布(圖a);然后,使用S-XRF,可視化了相同神經元中金屬離子的分布(圖b)。通過擬合mIRage和S-XRF圖像可以發現金屬鐵簇的位置與升高的β淀粉樣蛋白片層結構和氧化脂質高度相關(圖c和d)。
這項研究使用mIRage/S-XRF聯合單細胞成像證明了聚集鐵與升高的β淀粉樣蛋白片層結構共定位的顯著相關性,表明用 Aβ(1–42) 治療可能導致Fe失衡,進而可能導致脂質氧化。該研究表明mIRage無需標記即可直接對新鮮的生物樣本進行檢測,分辨率達亞微米水平,代表了單細胞化學顯微成像技術的新突破。
三、mIRage助力開發新型納米無定形載藥顆粒
中國醫學科學院醫藥生物技術研究所的王璐璐團隊開發了基于益生元的阿托伐他汀(AT)納米無定形載藥顆粒(PANA),借助mIRage成功實現對該載藥顆粒的原位成分分析。該結果以Prebiotic-Based Nanoamorphous Atorvastatin Attenuates Nonalcoholic Fatty Liver Disease by Retrieving Gut and Liver Health為題發表于Small Structures (影響因子13.9)上。
在本研究中,該團隊構建了一種基于益生元的AT 納米無定形載藥顆粒(PANA),通過恢復肝臟和腸道健康來提高 AT 對非酒精性脂肪性肝(NAFLD)的療效。非酒精性脂肪性肝病 (NAFLD) 的發病機制是多因素和復合性的,其中脂質代謝紊亂引起的脂毒性是主要危險因素之一。阿托伐他汀 (AT) 是廣泛使用的降脂藥物,然而,AT在腸道中的吸收率較低且該藥物會對腸道菌群造成破壞。與口服AT相變,構建PANA載藥顆粒在肝臟組織中表現出更好的藥物積累。此外,PANA干預有效恢復了腸道健康,重建的腸道菌群,并改善了腸道免疫力、屏障完整性和炎癥。
如上圖所示,該研究團隊使用mIRage對PANA的化學成分與空間分布進行了鑒定。上圖為菊粉(益生元主要成分)、AT、PANA的紅外光譜。PANA中隨機選擇的樣品的紅外拉曼光譜如圖C(左)所示。AT中1,523 cm-1處的羰基吸收在菊粉樣品中沒有信號為AT的特征峰(菊粉無此吸收峰)。按照 1,523?cm-1(綠色)和 1,036?cm-1(紅色)的映射,活性 AT 和益生元基質的圖像在掃描區域(黃色)顯示出相同的分布,這意味著 AT 和菊粉在顆粒中均勻混合。此外,在 PANA 顆粒中可以觀察到 AT 在 1,580?cm-1的苯吸收、1,457?cm-1的強 C-C 吸收和菊粉在 1,164?cm-1 的 C-O 拉伸。這些分析清楚地證實了活性藥物在益生元基質中的封裝和相對均勻的分布。
這項研究使用mIRage對載藥顆粒進行了化學顯微成像,準確表明不同化學成像在藥物顆粒內的空間分布,為制藥工程探索藥物成分的空間分布提供了線索。
四、mIRage助力檢測環境微塑料
南京大學季榮教授與美國麻省大學邢寶山教授等合作,利用先進的mIRage O-PTIR顯微光譜儀,建立了(微)塑料表面亞微米尺度化學變化表征方法,首先證實了蒸汽消毒引起硅橡膠老化具有普遍性,發現了一個曾被忽視但重要的人體及環境中微納塑料的來源。該工作以Steam disinfection releases micro(nano)plastics from silicone-rubber baby teats as examined by optical photothermal infrared microspectroscopy為題發表在Nature Nanotechnology(影響因子37.8)上。
該團隊成功應用mIRage化學成像顯微鏡揭示了硅橡膠奶嘴在蒸汽消毒過程中生成含有環狀/支化聚硅氧烷或聚酰亞胺微納塑料的過程及機制,發現了一個曾被忽視但重要的人體及環境中微納塑料的來源(見下圖)。
研究發現,硅橡膠嬰兒奶嘴的主要成分為聚二甲基硅氧烷(PDMS)及樹脂添加劑聚酰胺(PA)(圖b和c),在經過蒸汽消毒(100 °C)時表面發生降解并釋放出微納塑料顆粒(圖a)。借助mIRage化學成像技術,作者統計了奶嘴消毒過程中PDMS降解產生的1.5 μm以上塑料顆粒數量,并估算出正常奶瓶喂養一年進入嬰兒體內的該類微塑料總量約為66萬顆,比此前文獻報道的兒童從空氣、水和食物中攝入的熱塑性微塑料數量之和高出一個數量級;假如這些微塑料全部被排入環境,全球平均排放量可能高達5.2萬億個/年。
上述結果表明mIRage可以在無標記條件下對微塑料進行化學成像。
除了上述應用外,mIRage這一熒光、紅外、拉曼三合一的化學成像顯微還在多個科研領域有所應用:
1. 環境微塑料
微塑料顆粒(~600 nm)的O-PTIR光譜及成像分析
(引自Microscopy Today, 2022, 17, 3, 76-85)
2. 高分子材料
1210 cm-1處采集的PP/PTFE的O-PTIR光譜和顯微圖像
(引自Materials & Design, 211 (2021), 17, 110157)
3. 半導體
薄膜晶體管顯示器中污染物的O-PTIR分析
器件表面缺陷的紅外和拉曼光譜同步(同時間、同位置)分析
(引自Microscopy Today, 2020, 28, 3, 26-36)
4. 生命科學
腦組織的明場顯微圖像、O-PTIR光譜及成像分析
5. 文物鑒定
柯羅19世紀繪畫作品中鋅皂異質性的O-PTIR顯微光譜及成像分析
(引自Anal. Chem. 2022, 94, 7, 3103–3110)
mIRage國內部分發表文章一覽
? 中國農業大學借助mIRage成功實現對玉米粉中痕量微塑料的原位可視化表征。該工作發表在Science of the Total Environment上。
? 中科院過程工程研究所使用mIRage對利拉魯肽微球的藥物與載藥顆粒的化學成分與空間分布進行了鑒定,該成果發表在ACS Applied Materials & Interfaces上。
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