老年(nian)神(shen)經退行性疾病(bing)，如阿爾茨海默癥(AD)、肌萎縮性側索(suo)硬化癥、Ⅱ型糖尿病(bing)等(deng)，目(mu)前(qian)(qian)困擾著*大(da)約(yue)5億(yi)人，且這(zhe)個數字仍在(zai)不斷迅速增長。尤其(qi)是阿爾茲(zi)海默癥（占(zhan)70%以上），目(mu)前(qian)(qian)仍未有(you)行之有(you)效的(de)(de)(de)診斷方法，因此(ci)無(wu)法得到(dao)有(you)效的(de)(de)(de)治療或預防。盡管當代病(bing)理(li)學研究已經證實這(zhe)種(zhong)病(bing)理(li)變(bian)化與具有(you)神(shen)經毒(du)性的(de)(de)(de)β淀粉樣(yang)(yang)蛋白質的(de)(de)(de)聚集有(you)關，但其(qi)在(zai)神(shen)經元或腦組織(zhi)中的(de)(de)(de)聚集機制(zhi)目(mu)前(qian)(qian)尚不清楚。現(xian)有(you)的(de)(de)(de)方法, 如電(dian)(dian)子(zi)顯微(wei)鏡(jing)(jing)、免疫電(dian)(dian)子(zi)顯微(wei)鏡(jing)(jing)、共(gong)聚焦熒(ying)光(guang)(guang)顯微(wei)鏡(jing)(jing)、超分辨顯微(wei)鏡(jing)(jing)，通(tong)常都需(xu)要(yao)對樣(yang)(yang)品進行化學加工（標記染色等(deng)）,可(ke)能會對淀粉樣(yang)(yang)蛋白結(jie)構本身(shen)造成影(ying)響。而非標記方法，如表(biao)面增強拉曼光(guang)(guang)譜(pu)（SERS）和傅里葉變(bian)換紅外光(guang)(guang)譜(pu)（FTIR）, 前(qian)(qian)者受限(xian)于亞細胞(bao)水平上的(de)(de)(de)低信噪比、自發熒(ying)光(guang)(guang)及不可(ke)逆的(de)(de)(de)光(guang)(guang)損傷，后者其(qi)空間分辨率(lv)受限(xian)于紅外光(guang)(guang)波長（≈5–10 μm），且光(guang)(guang)譜(pu)可(ke)解譯性和準確性受到(dao)彈性細胞(bao)光(guang)(guang)散射所產(chan)生的(de)(de)(de)米(mi)氏散射效應(Mie scattering effects)的(de)(de)(de)嚴重(zhong)影(ying)響，使得直(zhi)接(jie)在(zai)亞微(wei)米(mi)尺(chi)度上研究淀粉樣(yang)(yang)蛋白質在(zai)神(shen)經元內的(de)(de)(de)聚集行為十分困難。

    美國Photothermal Spectroscopy（PSC）公司開發的全新非接觸式亞微米分辨紅外測量系統mIRage， 是基于光學光熱誘導共振（O-PTIR）技術，它克服了傳統FTIR技術的衍射限和米氏散射效應，紅外光譜空間分辨率高達500 nm，且無需對樣品進行標記, 不再需要衰減全反射（ATR）技術進行厚樣品測試，且能夠無接觸和無損探測樣品，全程對樣品無污染，可(ke)(ke)以(yi)幫助科研人員更全(quan)面地了(le)(le)解亞(ya)微米尺度下樣(yang)品(pin)表面微小區域(yu)的(de)(de)化學信息，使(shi)(shi)(shi)得(de)在亞(ya)細(xi)胞水(shui)平(ping)揭(jie)示生物分(fen)子結構成為(wei)(wei)了(le)(le)可(ke)(ke)能。美國(guo)Photothermal Spectroscopy（PSC）公司開發(fa)的(de)(de)全(quan)新非接觸式亞(ya)微米分(fen)辨(bian)紅(hong)(hong)(hong)外(wai)測量(liang)系統mIRage（如圖1A所(suo)示），使(shi)(shi)(shi)用(yong)(yong)可(ke)(ke)見探測束（532 nm）來測量(liang)樣(yang)品(pin)在脈(mo)沖紅(hong)(hong)(hong)外(wai)光(guang)束照射(she)下的(de)(de)紅(hong)(hong)(hong)外(wai)光(guang)熱響應，具體體現為(wei)(wei)樣(yang)品(pin)反射(she)率(lv)的(de)(de)變化，由(you)于(yu)使(shi)(shi)(shi)用(yong)(yong)了(le)(le)可(ke)(ke)見光(guang)作為(wei)(wei)檢測光(guang)，使(shi)(shi)(shi)得(de)其空(kong)間分(fen)辨(bian)率(lv)不(bu)再依賴于(yu)入射(she)紅(hong)(hong)(hong)外(wai)光(guang)的(de)(de)波長，且(qie)單定(ding)探測光(guang)束的(de)(de)使(shi)(shi)(shi)用(yong)(yong)還可(ke)(ke)以(yi)消除(chu)米氏散(san)射(she)效應。

                                 

圖1. (A) 美國PSC公司非接觸式亞微米分辨紅外測量系統mIRage實物圖；（B）亞微米紅外成像示意圖：神經元樹突的AFM形貌圖,其中神經元直接在CaF₂基底(di)下(xia)生長(chang)。mIRage采用兩束(shu)共線(xian)性光(guang)(guang)(guang)(guang)束(shu): 532 nm可見(綠色(se))提取光(guang)(guang)(guang)(guang)束(shu)和脈(mo)沖紅外(wai)(紅色(se))探測光(guang)(guang)(guang)(guang)束(shu)，樣品(pin)的(de)(de)(de)光(guang)(guang)(guang)(guang)熱響應(ying)被檢(jian)(jian)測為樣品(pin)由于對(dui)脈(mo)沖紅外(wai)光(guang)(guang)(guang)(guang)束(shu)的(de)(de)(de)吸收(shou)而引發的(de)(de)(de)綠色(se)光(guang)(guang)(guang)(guang)部分強度(du)的(de)(de)(de)損失，使(shi)紅外(wai)檢(jian)(jian)測的(de)(de)(de)空間分辨率(lv)提高到≈500 nm. (C) 小鼠大腦皮層初神(shen)經(jing)元(yuan), 在CamKII促(cu)進下(xia)表達為tdTomato熒光(guang)(guang)(guang)(guang)蛋白，使(shi)得神(shen)經(jing)元(yuan)結構填滿紅色(se)，圖片標尺為20 μm。(D) 圖C區域(yu)放大圖片，箭頭指示(shi)樹突上的(de)(de)(de)神(shen)經(jing)元(yuan)刺。

    因為(wei)上述的(de)巨大技(ji)術(shu)勢和(he)突破，非(fei)接(jie)觸式亞微(wei)米分辨紅(hong)外測(ce)(ce)量系統(tong)mIRage在生物(wu)(wu)(wu)(wu)學域技(ji)術(shu)有廣泛的(de)應用前景和(he)潛(qian)力，可(ke)應用于諸如細(xi)胞學研究（蛋白(bai)質(zhi)、磷脂結構分析，紅(hong)細(xi)胞、巨噬細(xi)胞成像等），臨床致病(bing)菌/病(bing)原(yuan)微(wei)生物(wu)(wu)(wu)(wu)鑒定，癌癥診斷（細(xi)胞/組織(zhi)(zhi)），牙科(ke)/骨病(bing)變/眼科(ke)檢測(ce)(ce)，生物(wu)(wu)(wu)(wu)大分子(zi)損(sun)傷，生物(wu)(wu)(wu)(wu)組織(zhi)(zhi)識(shi)別，以及生物(wu)(wu)(wu)(wu)藥物(wu)(wu)(wu)(wu)檢測(ce)(ce)，法醫學等。

    近日，瑞典隆德大學的Klementieva教授團隊與美國PSC公司的Mustafa Kansiz博士合作，使用全新非接觸式亞微米分辨紅外測量系統在亞微米尺度上研究了淀粉樣蛋白沿著神經突直到樹突棘的聚集行為（圖1B和C），這是以往的實驗技術手段所不可能實現的。在該研究中，他們使用了大腦皮層初神經元，這是因為它們易發生AD病變，且具有*的結構。初神經元的這種形態征使得可以在單個神經元層面上來測試全新非接觸式亞微米分辨紅外測量系統的分辨率和準確性。，他們在反射模式下獲得了高質量的紅外光譜，且不受米氏散射或基線失真等人為因素的干擾(圖2A,B)。值得注意的是，全新非接觸式亞微米分辨紅外測量系統其約為400 nm的橫向分辨率，使得他們能夠通過比較1740 cm^-1處的峰強度來檢測脂質含量的差異，以及通過對比酰胺II (1540 cm⁻¹)與酰胺I征峰強度(1654 cm⁻¹)的(de)比值來比較氨基酸(蛋白質)的(de)種(zhong)類(lei)和數量上的(de)差異(yi)(圖(tu)2C,D)。這是科學(xue)家們*獲取(qu)單個(ge)樹突棘的(de)高(gao)分辨率的(de)化(hua)學(xue)圖(tu)像和紅(hong)外光譜，以往其它測試方(fang)法(fa)是無法(fa)做到(dao)的(de)。

圖2. 使用非接觸式亞微米分辨紅外測量系統mIRage觀察初神經元結構。 (A) 在1650 cm^-1處獲得的神經元的紅外圖像，顯示了蛋白質的分布; (B)中對應原始紅外光譜的位置用數字和圓點表示，圖片標尺為20 μm；（C）在1650 cm^-1處獲(huo)得(de)的(de)(de)樹突的(de)(de)紅(hong)外(wai)圖像，數(shu)字表(biao)示D圖中獲(huo)得(de)光(guang)譜(pu)的(de)(de)位(wei)置，圖片(pian)中標尺為20 μm；（D）在C圖中兩點處取的(de)(de)歸(gui)化(hua)紅(hong)外(wai)光(guang)譜(pu),體現了該方法的(de)(de)亞微米空(kong)間分辨率(lv)。紅(hong)色箭頭(tou)表(biao)示蛋白質結(jie)構(gou)的(de)(de)化(hua)學(xue)變化(hua)。

    為了在亞細胞層面上定位神經元中β片層結構，作者對APP-KO神經元進行了為時半小時的合成Aβ(1-42)處理（2×10−6 M），并使用非接觸式亞微米分辨紅外測量系統mIRage進行了化學結構的成像分析（圖3A）。對Aβ處理后的APP-KO神經元的紅外光譜進行分析證實，β片層結構可以在亞細胞水平上進行分辨。有趣的是,純Aβ(1-42)纖維在1625 cm⁻¹位置處有征的紅外峰，當加入到神經元結構中后，β片層結構的征峰移動到1630 cm^-1處，表明淀(dian)粉(fen)樣(yang)原纖(xian)維結構發(fa)生了變(bian)(bian)化，可(ke)能是(shi)由于其與細胞(bao)蛋(dan)白和(he)/或細胞(bao)膜發(fa)生相互作用(yong)導致(zhi)的(de)(de)(de)(de)（圖3B, C）。基于該發(fa)現(xian)，我們可(ke)以得出(chu)，在(zai)神經元中的(de)(de)(de)(de)淀(dian)粉(fen)樣(yang)蛋(dan)白的(de)(de)(de)(de)構型變(bian)(bian)化可(ke)能會引發(fa)阿爾茨(ci)海默癥進(jin)程中的(de)(de)(de)(de)不同機(ji)制(zhi)。為進(jin)步了解其形成(cheng)機(ji)制(zhi)，更(geng)(geng)多的(de)(de)(de)(de)方法學研究變(bian)(bian)得更(geng)(geng)加必要(yao)，如(ru)(ru)將非接觸(chu)式亞微米分辨紅外與免疫熒光(guang)顯微鏡結合起來，這種多模(mo)態(tai)成(cheng)像模(mo)式可(ke)以在(zai)不同的(de)(de)(de)(de)細胞(bao)層(ceng)面上(shang)更(geng)(geng)詳細分析征蛋(dan)白的(de)(de)(de)(de)結構變(bian)(bian)化，如(ru)(ru)前突(tu)(tu)觸(chu)或后突(tu)(tu)觸(chu)，囊泡(pao)(溶(rong)酶體或內溶(rong)酶體)或其他細胞(bao)器。

圖3. 使用非接觸式亞微米分辨紅外測量系統Mirage觀察β片結構在處理后的初神經元中的聚集行為。（A，B）APP-KO初神經元在1650和1630 cm^-1處的明場和光熱紅外成像，彩色標度表示光熱振幅的強度，從小值(藍色)到大值(紅色)，閾值為50%(以0為中心)，插圖為放大或疊加后的紅外成像圖，圖片標尺為20 μm；（C）神經元中淀粉樣蛋白結構在2×10−6 M Aβ(1-42) (紅色)處理或不處理(綠色)后分別對應的紅外光譜。β片結構對應的征紅外峰用紅色箭頭表示，光譜數據點間距為2 cm⁻¹，數據(ju)進行50次均化(hua)處理。

    綜(zong)上所述(shu)，借助全新(xin)非接(jie)觸式(shi)亞(ya)微(wei)米(mi)分(fen)辨(bian)紅外(wai)測量系統(tong)mIRage，科學家成(cheng)功(gong)*揭(jie)示了初神(shen)(shen)經元的(de)(de)分(fen)子結(jie)構，無需標記(ji)，且因為(wei)該技術是在非接(jie)觸模式(shi)下(xia)工作，不會(hui)對神(shen)(shen)經元造(zao)成(cheng)損傷，這在研究(jiu)脆弱(ruo)或粘性的(de)(de)物質時顯得尤為(wei)重要。另外(wai)，該技術還(huan)能獲得亞(ya)微(wei)米(mi)尺度的(de)(de)紅外(wai)光(guang)譜，且不含由(you)于(yu)背景(jing)失真或米(mi)氏散(san)射(she)造(zao)成(cheng)的(de)(de)散(san)射(she)偽影。技術進步表(biao)明，全新(xin)的(de)(de)非接(jie)觸式(shi)亞(ya)微(wei)米(mi)分(fen)辨(bian)紅外(wai)測量系統(tong)mIRage現在可以(yi)用(yong)來做活細胞成(cheng)像,并(bing)保持相同(tong)的(de)(de)亞(ya)微(wei)米(mi)空間(jian)分(fen)辨(bian)率。在這種情(qing)況下(xia)，全新(xin)的(de)(de)非接(jie)觸式(shi)亞(ya)微(wei)米(mi)分(fen)辨(bian)紅外(wai)測量系統(tong)有望在β片(pian)層結(jie)構在活神(shen)(shen)經元的(de)(de)突觸附近的(de)(de)化學成(cheng)像中(zhong)發揮關鍵作用(yong)，并(bing)提(ti)供個(ge)新(xin)的(de)(de)機會(hui)來研究(jiu)神(shen)(shen)經毒性淀粉樣蛋白如何從個(ge)患(huan)病的(de)(de)神(shen)(shen)經元傳播到個(ge)健康的(de)(de)神(shen)(shen)經元，揭(jie)示阿爾茨海默癥的(de)(de)形成(cheng)和發展機制。該工作發表(biao)在2020年的(de)(de)Advanced Sciences上（DOI: 10.1002/advs.201903004）。